最近要合成多肽用于制备抗体,却在设计上破费不少脑筋,倒也是学习历程。起首根据研究目的寻觅一段序列,15aa摆布,一定是保守区内,在不同种属间不变;确定是胞内还是包外段(我选择的分子复杂,有六次跨膜布局);然后分析最近肽的亲水性,当然亲水氨基酸高点好(2.0以上,);blast种属间的同源性(ncbi中的protein blast),看下其他卵白是否也有此序列,用于鉴定诊断的抗体最好此段序列在同一家族的其他分子中没有,才具备特别优异性;最后进一步分析肽段的抗原表位的多少及其二级布局的形成,如:a-螺旋,b-片层,a-转角等。最终根据下面文章全面分析合成肽的特性。
抗体是生命科学研究中不可或缺的工具之一,应用范围包孕卵白质表达检测和鉴定、卵白质加工、卵白质在细胞内的定位、抵抗力中和反映、卵白质同源布局域研究、卵白质纯化和疾病的抵抗力诊断和治疗。尽管抗体的制备历程不存在技能难点,可是抗原的选择和所制备抗体的用场对可否获得一个优质高效的抗体相当重要。以下将对抗原多肽的设计、偶联策略等逐一介绍.
抗原设计
起首选择合适的多肽序列,明确最终产物的用场对选择序列很是重要。如果仅仅需要生产针对卵白质某个区域的特别优异抗体,比如研究卵白质n端的前提物,我们就需要设计n结尾的多肽抗原。如果抗体的施用目的是识别润色的氨基酸,如磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,已酰化赖氨酸等,就必须对多肽进行响应的润色。如果抗体最终用来识别天然状况下的卵白质,对抗原的设计就要求更高。一般情况下抗血清能够识别用来抵抗力的多肽序列,可是不一定识别卵白质的折叠布局。卵白质的抗原决议簇一般由6-1二个氨基酸组成,呈连续性或非连续性序列。连续性抗原决议簇由连续的氨基酸序列组成,而非连续抗原决议簇包孕一组非连续氨基酸,这些个氨基酸由于卵白质的折叠而形成在空间上彼此毗邻。针对连续性抗原决议簇的抗体能够识别没有被埋藏在卵白质内部的序列,而非连续性抗原的抗体可否识别抗原决议簇决定于于用于抗体生产的多肽是否存在二级布局。
氨基酸序列的亲水性、流露性、软而韧性决议了多肽的抗原性。许多水融性的天然状况下的卵白质其亲水序列暴露在外测,而疏水性氨基酸序列包埋在内部。抗体结合卵白质表面的抗原决议簇,别的抗原决议簇软而韧性比较高。卵白质的c结尾经常暴露在外测而且有较高的软而韧性,因此经常被用来作为抗体生产的抗原。可是如果c结尾是跨膜卵白质的膜内部门,该序列可能由于疏水性太强而不适合用来作为抗原。同c结尾序列近似,卵白质的n结尾序列也经常暴露在卵白质的表面,同样为首选抗原序列。
预测卵白特性(例如亲水性、疏水性)及二级布局(例如α-螺旋,β-折叠,β-盘旋)的一些算法有助于选择流露性较高,有抗原性的内部序列以用于抗体生成。常见预测性算法就象次三种,hopp及woods所描写的亲水性曲线给卵白序列中的每一个氨基分配一个均等亲水性值,对于一系列的相邻氨基,均等亲水性的无上点通常就位于抗原决议簇或在其附近。kyte及doolittle所提出的另外一算法略有不同,它首要是衡量卵白序列的亲水性及疏水性趋势,该算法对于预测某卵白的外部及内部区域很是有用。卵白的二级布局则可以路程经过过程chou/fasman或lim所提出的算法来预测。流露性或易接近区常常和螺旋区或延展的二级布局区相邻。而且,具备β-盘旋或双性螺旋特性的序列区也具备较好的抗原特性。目前有许多商用软件包都施用了这些个不同的算法,例如macvectortm,dnastartm及pc-genetm。要想预测精确,不能只施用一种算法。结合各类不同的预测方法来预测抗原性区域,可使乐成率大大提高。
抗原性区域确定以后,接下来要确定多肽的长度。关于选定多肽长度有两种不同的观点。一种观点以为长的多肽(20-40个氨基酸)比较好,因为长的多肽没有疑问会增长抗原基的数量。另外一种观点则以为小的多肽更有效,施用小的多肽能保障所孕育发生抗体的位点特别优异性。但有一点儿是明确的,不管长度怎样,所选多肽必须能够较容易地路程经过过程生化合成获得,而且能溶解到水溶性缓和冲突剂进行载体卵白的耦联。由于受副反映的影响较大,高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高纯度合成,而且常常会含出缺失性序列。另外一方面,太短的多肽(10个氨基酸)则会孕育发生识别特别优异性很强的抗体,以至于没有办法识别整体卵白,或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般是10-20个氨基。这种长度的多肽序列会最大程度的减小生化合成困难,具备一定的水溶性,也会具备一定程度的二级布局。
抗原准备-耦联方法
化学合成的多肽抗原是小分子,本身很难具备好的抗原性,只能诱导动物孕育发生很弱的抵抗力反映,因而与载体卵白耦联是很重要的。载体卵白含有很多抗原决议基,能够刺激t-帮忙细胞,进而诱导b-细胞反映。用于与多肽耦联的载体卵白有多种,此中最经常使用的是keyhole limpet hacyanin(klh)血蓝卵白(keyhole limpet hocyanin,klh),牛血清白卵白(bovine serum albumin,bsa),卵清卵白(ovalbumin,ova)和牛甲状腺球卵白(bovine thyroglobulin,thy)。klh具备更高的抗原性,是最为经常使用的多肽耦联载体。bsa也经常使用来作为多肽载体,但由于bsa经常被用做检试验验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。
设计合成性多肽常常被纰漏的一个方面是怎样将多肽耦联到载体卵白上。例如,n-端序列需要路程经过过程c-端氨基酸耦联,而c-端序列则需要路程经过过程n-端氨基酸耦联。内部序列则可以耦联到不论什么一端。内部序列耦联的另外一考量则是将非共轭端酰基化或氨基化,因为原卵白分子序列中不会含有带电荷的结尾。最经常使用的耦联方法都是基于自由氨基(alph-氨基或lys)、sufhydryl(cys)或羧基集团(asp,glu,或alpha-羧基)的存在。所有的耦联方法都应该是路程经过过程羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体卵白上。所选序列来不得多个残基都能介入所选耦联化学反映。如果多个反映位点存在,可以考虑将多肽序列缩短,或选择所有反映位点都位于一端的多肽。对于内部序列通常会施用离所预测抗原位点较远的一端进行耦联,这样可以制止可能的屏蔽需要别人解答的题目。
