Table 1 - Topselling peptide drugs
进入临床的多肽药物持续增加：在20世纪70年代只有1.2个，80年代增加到4.6个，90年代9.7个，21世纪初有16.8个。而现在已经有大约140个多肽药物处于临床阶段，超过400个处于临床前试验（图一）。2000年之前，进入临床研究的多肽大部分是用于癌症治疗（18%）和代谢紊乱（17%）2。现在超过100家制药和生物技术公司正在购买多肽药物研发项目。
多肽治疗的利润巨大增加有很多原因。最主要的原因是在近十年多肽的药物传递系统有很大的改进。特定多肽可以穿过细胞膜，因此被用于靶向药物的载体。在医疗诊断、健康保健、抗菌和化妆护肤方面多肽的使用也越来越多。
每年有大量的多肽API需求-大约1400kg/年，40%左右是由CMO生产。当大量的多肽药物成为通用名药以及越来越多的多肽药物通过审核，CMO比例在2017年还会有巨大提升。此外，现在应该着重于提高生产方法以增加产率并确保质量。大的多肽CMO公司会购买大型的制造设备、设施国际性的战略定位以及创新生产方法以提升他们的能力。
多肽生产
很多化学反应和方法被开发来合成多肽链，经典的方法有：液相多肽合成（LPPS），反应在溶液中进行，使用被保护的氨基酸，每一次偶联和去保护后需要从溶液中分离。
固相多肽合成（SPPS）在不能溶解的聚脂上合成多肽链，从而简化了合成过程。每一次去保护后被保护的氨基酸被一个一个的添加到树脂上不需要中间的分离步骤。在树脂上合成了需要的长度后，将多肽切割下来并通过色谱层析纯化。对于生产特定的多肽也有可能混合使用液相合成和固相合成这两种方法。
显而易见的是，对于高纯度药物应用短链多肽（<15个氨基酸）用液相合成更经济，所以通常用液相多肽合成的方法大规模的合成这种多肽。尽管液相多肽合成需要很多步骤，液相比固相多肽合成技术能够更经济的生产产品规模比较大的多肽。然而由于工艺的复杂性，液相合成并不是长肽的可行性选择。
在过去十年，固相合成成为大多数多肽的首选。有两种方法：Boc法和Fmoc法，后者由于其工艺简单以及可避免氟化氢的毒害而越来越流行。
在多肽合成中运用正交保护基团为固相多肽合成技术开发了合成复杂多肽的新方法。固相多肽合成可以使用不同类型的聚苯乙烯基料树脂，最常用的是Wang树脂、氯代二苯基甲烷（2-Chlorotrityl chloride）、Rink amide树脂和菲尔德树脂。Fmoc-保护氨基酸广泛应用于商业合成。
可以结合固相合成和液相合成的方法合成长的复杂的多肽。例如，通过液相合成合成一些短的片段，然后将它们连接到固相树脂上形成更长的肽。另外一种情况则是，多肽片段可以在固相树脂上合成，然后从树脂上切割下被保护的多肽片段，最后在液相中连接各个受保护片段。
纯化和分离
在合成完成后，多肽需要被纯化，通常纯度要大于95%以满足应用要求。使用疏水作用机理的反相液相色谱（RP-HPLC）被认为是最有用的多肽纯化方法。其特征在于使用一个固定相和一个含有有机溶剂如乙腈或乙醇的液相。
在反相树脂上运用不同的色谱分析方法进行大规模的多肽纯化。这些方法最常用的都是基于C4、C8、C18烷基链连于二氧化硅表面的硅胶树脂。
现在，随着轴向压缩（dynamic axial compression，DAC）色谱柱以及优质相对低成本的反相树脂填料的广泛使用，使得大规模的多肽纯化比以前更容易。一个20cm直径的柱每个月纯化千克级的多肽。
（中肽生化GMP多肽生成车间：SPPS反应器, 20cm RP-HPLC柱和200升托盘冻干机）纯化后，多肽需要分离和冻干。和挂瓶冻干机一样，多肽制造厂使用大的商业级生产冻干机以增加产率和提高冻干参数的控制。
生产挑战
多肽生产技术已经成熟，大多的多肽制造商可以生产几百千克级的多肽API。越多的多肽药物准备进入市场，CMO厂商便存在越多的挑战和压力，以提供多肽更多的经济作用，符合GMP要求又不影响质量和完整性。而且，之后对于多肽复杂性、尺寸、修饰、偶联方法，稳定性、和纯度的要求也会增加。
本文是对厂商挑战的预测。从合成的角度看，目前用于固相多肽合成的树脂不是重复使用的，且相对于其他原材料来说很贵。
尽管最近几年，Fmoc基团保护的普通氨基酸的价格有所下降，但是很多特殊氨基酸和非天然氨基酸衍生物会提高产品的成本。在多肽合成过程中会用到大量的树脂（每克树脂只有0.5-1.0mmol的反应位点是可用的）和额外的氨基酸（2-3倍）。
像二氯甲烷和二甲基甲酰胺被大大过量的用于树脂浸泡和冲洗的过程，从而造成相当大的浪费。通常，洗1克树脂需要最少5ml溶剂，也就是说合成一条20个氨基酸的多肽需要1千克的树脂，大约要浪费1000升的溶剂。
废料处理和溶剂的量大约是总产值成本的10%。合成完之后，多肽需要用TFA从树脂上切割下来，然后用大量的醚析出，这样有进一步造成了大量的浪费。合成多肽的纯度很大程度上依赖于合成过程的有效性、其本身的性质和使用的原材料的质量。在合成过程中未完成的偶联和去保护会导致缺失序列和杂质。
在生产过程中纯化是最重关键的步骤。特定多肽的难溶解和聚**造成纯化困难，因此在纯化前仔细考虑多肽的性质是很重要的。像环化和二硫键形成等修饰是需要在纯化之前完成的。
这种处理之后的多肽稀释（1毫克多肽每毫升）使纯化更难，不只是因为大量体积的溶液被泵进HPLC柱，也因为通过氧化作用形成了样品聚合。从目标多肽中出去相近的杂质需要用不同的缓冲系统和工艺来进行多种纯化步骤。
纯化占多肽生产成本的20%以上。溶剂的价格经常波动进一步增加了纯化的成本，如RP-HPLC纯化所需的乙腈。这种溶剂通常不会回收或重复使用。大量多肽纯化后的冻干也增加了大量的成本。
多肽API的生产需要完全符合GMP法规和FDA法规。所有的原料需要检验，所有的生产过程需要在控制范围内。纯化和冻干需要在10万级洁净区，包装需要在万级洁净区。
最新的固相多肽合成
右图是固相多肽合成的流程表，自从Merrifield发明固相多肽合成技术后至今还没有什么技术可以代替，主要是因为它能方便地高产能地合成长肽。
固相多肽合成比传统的一步一步合成更快且能够全自动或者半自动操作。在大量生产多肽是，它能够半自动处理溶剂传递、偶联反应和废液处理，然而液相多肽合成局限于合成更短的多肽并需要更长的时间。
其他技术如：发酵和重组最近也被应用于生产多肽像达托霉素（cubicin）和利拉鲁肽（liraglutide）。这些方法可以很容易放大生产大量的多肽，但是他们的应用被诸如发酵过程中需要使用特殊的酶以及重组表达很难引入非天然氨基酸所限制。
提高固相多肽合成和液相多肽合成技术对于低成本多肽生产是必要的。引入减少废物生产、提高偶联效率和总产量的新方法会降低成本。
在大量合成过程中溶剂回收利用是可行的选择。最开始净化车间的投入可能会比较高，但是一旦系统建立便可用于溶剂重新利用，这样也会减少废物处理成本。有效的供应链管理以及从可靠的供应商购买的稳定质量的原材料是大规模生产所必要的。
总的来说，高质量的原材料、周期的管理、溶剂的循环利用、使用有效的偶联试剂以及收敛策略可以提高多肽合成工艺。例如，一个超过50个氨基酸的难肽可以在固相载体上通过片段缩合合成，从而比一步一步的固相合成达成更好的得率和纯度。
对于使用反相树脂柱的工业级纯化，静态相中颗粒的形状和尺寸是重要的考虑因素。球形颗粒比不规则形的要好。在DAC时过度使用柱子会导致不规则形状的颗粒形成。
对于结合二氧化硅相颗粒的大小是另一个很重要的性质，会强烈地影响柱的效果。对于特定项目持续使用的柱子的效率进行定期的检查是很重要的。
对于多肽纯化RP-HPLC是有效且昂贵的。给合成的多肽粗品粗纯化是个很好的方法，可以将杂质去除掉。这是可以实现的，如：将多肽粗品溶液加到离子交换柱上。经过这一步去除杂质（如在多肽最终去保护后的副产品）后会得到一部分富集的目的肽。
这种策略对于包含二硫键通过氧化可折叠反应多肽的稀溶液（~1 mg/ml）来说是非常经济的。预纯化可以除去原料聚合体以及很多其他杂质，保证浓缩的多肽溶液加到RP-HPLC柱上进行二级纯化。例如，使用这种方法，一个氧化后200L的30%纯度的多肽经过离子交换柱后可以得到20份超过75%纯度的多肽溶液。
用于离子交换过程的非有机溶剂以及这种技术的全部纯化成本比使用两次RP-HPLC纯化要便宜。如果直接上未经过预纯化的原料聚合物和杂质也会顺坏RP-HPLC柱。离子交换柱比RP-HPLC柱更易于清洗和重复使用。
另一种降低生产成本的方法就是重复使用乙腈。在特定情况下使用甲醇或异丙醇等更便宜的溶剂代替可能也是可行的。使用高浓度的多肽溶液可以减少冻干成本，可以纯化后通过蒸馏，高浓度有机洗脱液洗脱或膜过滤等技术得到高浓度的多肽
最新的液相多肽合成LPPS
近年来研究人员开发出了很多不同的方法来提高多肽合成技术。在修改的LPPS过程中，用氨基酸和多肽酸代替氨基酯和多肽酯，可以减少在THF/水混合溶液中过多的五氟苯酚活性酯。
由于溶解性低，通过控制条件进行酸化的多肽酸中间体以及选择性提取去除活化酯更容易分离到高纯度。不同于经典的重复溶解相流程，这种方法不需要很久的中和反应并大大地降低了用于获得多肽中间体的操作单位的数量3。
另一个研究使用了称之为膜加强肽合成（membrane-enhanced peptide synthesis,MEPS）的新技术平台，这种技术有利地结合了有机溶剂纳米过滤和LPPS。第一个氨基酸链接到可溶性的聚乙二醇锚上，随后重复偶联和去保护步骤，直到多肽延伸到需要的长度。每一步反应和通过溶剂稳定的膜透析过滤掉残留的副产物和多余的试剂，保留目标多肽4。
据报道在同样的条件下，用MEPS法生产的多肽的纯度比SPPS的要高很多。MEPS综合了LPPS的优点，又避免了现在难以实现的纯化步骤。
一组日本的研究人员设计了一个有效的合成C-末端有酰胺基团的多肽。这种方法需要在C-末端加一个长脂肪酸链保护基团，然后重复简单的反应和沉淀步骤，此方法结合了LPPS和SPPS的优点。使用这种方法，可以很成功的合成高产量高纯度的疏水多肽，而用SPPS方法是不能满意的合成这种多肽的5。
最近成功的开创了一种可溶性标签辅助的LPPS，由于简单的疏水苯甲醇很容易从天然原料中获得，结合LPPS和SPPS的特性，在每一步都能产生很好的沉淀。这种方法也能有效地用于片段偶联，使化学合成许多生物活性多肽得以实现6。
总结和展望
随着对多肽量以及多肽尺寸、修饰以及纯度要求的增加，找到更好的生产多肽的途径是很有必要的。进一步开发和提高合成多肽化学、固相支持材料、纯化途径以及分离方法是目前大规模合成多肽的重要挑战，特别是高生产成本和负责的修饰。
很多CMO公司已经聚焦于这些领域以能够供应大量的价格优惠的高活性多肽API。合适的基础设备建设对于满足未来上千千克的多肽需求也是很有必要的。
根据FDA和GMP规章战略性的部署全球生产是减低生产成本而又不影响质量和管理的一条可行途径。在这些区域使用高质量的散装低价原材料同时雇佣高质量工作人员是成功的多肽生产运营的可行的方法。
References
1. A.M. Thayer, Chem.Eng. News 2011, 89, 13-20
2. PeptideTherapeutics Foundation, Development Trends for Peptide Therapeutics Report,San Diego, 2010
3. C. Meneses etal., J. Org. Chem. 2010, 75 (3), 564-569
4. S. So et al.,Org. Process Res. Dev. 2010, 14 (6), 1313-1325
5. D. Takahashi etal., Org. Lett. 2012, 14 (17), 4514-4517
6. Y. Okada etal., J. Org. Chem. 2013, 78 (2), 320-327
