关于研究蛋白质细胞定位的几种方法

    真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的工作己取得很大进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白的定位过程也不同。

    研究蛋白的亚细胞定位可采取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察;蔗糖密度梯度离心;多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金标记、免疫荧光、与gfp构建融合基因等常用方法。

金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了可喜的进展。胶体金是由氯金酸（HAuCL₄）在还原剂如白磷 、抗坏血酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。

免疫胶体金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白的定位研究，是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜水平的免疫金染色是目前较理想的免疫定位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和具有双重标记功能等优点。例如用连有15nm金颗粒的GFP单克隆抗体以及连有lOnm金颗粒的过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金标，证明CAT1-GFP定位在过氧物酶体(Akane Kamigaki eta1.,2003)。

根据抗原与抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原或抗体复合物上含有各种颜色的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激光的照射而发出各种颜色的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

S. pagny等(2003)将XYIT36: GFP转入拟南芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发现GFP的绿色荧光与使用Lewis抗体所做的免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不同部位。说明XYIT36: GFP定位在高尔基体。

    海洋生物发光是个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca²⁺结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光。发光机制如下:

    GFP由gfp基因编码，具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约27kD。GFP有两个吸收峰，最大吸收峰在395nm，在475nm还有一个吸收峰，前者由紫外光激发，后者由蓝光激发。发射光谱也有两个峰值:509nm和540nm,呈绿色或黄绿色荧光。

    GFP荧光的产生主要归功于分子内第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白折叠环化后，在O₂存在下分子内第67位甘氨酸的酰基对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团，该过程可自动催化合成。GFP晶体结构(如图)显示，蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm,宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段覆盖，生色团位于大空腔内。